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液质联用技术(LC-ESI-MSMS)的蛋白质组学分析技术服务

基本原理
      液质联用,即将液相色谱(HPLC)的分离功能与电喷雾质谱(ESI-MS)的检测功能结合起来,用于对蛋白质或者多肽的混合物进行高通量的自动化分析。蛋白质酶解产物或者多肽混合物根据其性质,通过液相色谱分离后,经电喷雾技术离子化以后进入质谱进行MS 和MSMS的分析,最终通过数据库搜索得到定性定量信息。
      为了得到更好的蛋白质多肽分离效果,常会利用其不同的性质进行多维色谱分离(MudPIT),比如最常用的阳离子分离和反向色谱分离联用技术(SCX-PRLC),再通过质谱分析,从而鉴定到更多低丰度的蛋白质,实现更多低丰度蛋白质的检出。
      目前市场上较为主流的液相色谱主要有Agilent,Waters,Shimadzu,Microm几家,电喷雾质谱主要有Thermo 的LTQ及其衍生的LTQ-Obi trap, ABI的Q STAR,Bruker的HCT,Waters 的Q TOF,以及Agilent的6500等。
主要服务内容:
      1、对于以下种类的混合蛋白质的高通量鉴定:(1) 组织,体液,培养细胞,细胞培养上清液中的混合蛋白;(2) SDS-PAGE胶分离的蛋白质条带;(3) IP 下来的蛋白质及其用SDS PAGE分离后的条带


2、差异蛋白质组学的分析:
      (1)ITRAQ技术。 由ABI(Applied Biosystem)公司开发的同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ, (isobaric tags for relative and absolute quantitation ) )技术,是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术,具有较好的定量效果、较高的重复性,并可对多达八种不同样本同时进行定量高通量分析。iTRAQ的操作程序一般如下:将蛋白质裂解为肽段,然后用iTRAQ试剂进行差异标记。再将标记的样本相混合,进行2DLC –MSMS分析鉴定,再通过相关软件进行定性和定量分析。该技术可广泛应用于不同状态或处理的生物体,临床的组织,体液以及细胞样品的差异蛋白质组学分析中。



      (2)SILAC(Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Cultures) & pSILAC(pulsed SILAC). SILAC的基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸,细胞经5-6个倍增周期后,稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合,经分离、纯化后进行质谱鉴定。pSILAC 技术是在SILAC的技术上,先将细胞置于含正常同位素氨基酸培养液中进行培养(L),对细胞进行一定刺激处理后,将不同处理方法的细胞分别置于中型(M)和重型(H)的培养基中进行培养,由M:H即可得出单纯由刺激引起的蛋白质差异表达情况。


      (3)ICAT 技术(Isotope coded affinity tag).分别用D0和D8试剂标记同种样品的不同形态(如正常细胞和病变细胞)中的所有蛋白质(如D0标记正常细胞,D8标记病变细胞),试剂选择性与胱氨酸反应,然后把两种反应产物混合在一起进行酶解,用亲和色谱分离被标记的肽段,进行LCMSMS测定,如一对峰相差8个质量数,则为同一种蛋白质,由此由D0和D8峰的相对强度进行相对定量。

3、蛋白质翻译后修饰分析。包括 蛋白质磷酸化分析和 蛋白质糖基化位点分析。

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